panxian0527
来源:未知作者:admin时间:2010-11-01 16:53点击:
参赛网友：panxian0527
实验室名称：复旦大学生科院遗传所吕红组
是否采用密理博Immobilon转印膜：millipore PVDF膜
PVDF膜孔径：0.45 uM
使用抗体：抗体：
anti-histone H4 (07-108; Millipore)；
anti-acetyl histone H4 (Lys5) (07-327; Millipore)；
anti-acetyl histone H4 (Lys8) (07-328; Millipore )；
anti-acetyl histone H4 (Lys12) (07-323; Millipore )。
其他实验试剂：显色液
实验步骤（样品及检测底物必填）：
Western blot步骤
1) SDS-PAGE分离蛋白。
2) 如果采用PVDF膜转移，先用甲醇浸湿PVDF膜，再转移到电转移液中平衡15分钟。如果采用硝酸纤维素膜转移，直接将该膜转移到电转移液中平衡15分钟。
3) 将电泳胶浸泡于电转移液中平衡15分钟。
4) 裁12张与电泳胶同样大小的Whatman滤纸，置电转移液中平衡。
5) 按下列顺序安放在半干式电转移仪(Biorad)上：正极—6层滤纸—PVDF膜 或者硝酸纤维素膜—电泳胶—6层滤纸—负极。
6) 电转移：电压23V，0.4~1小时。蛋白越小，时间越短，蛋白越大，时间越长。
7) 电转移完成以后，可以对电泳胶染色。同时可将PVDF膜或者硝酸纤维素膜上含有Marker的部分剪下染色，观察电转移的效果。
8) 在水平摇床上，将膜置于20 ml封闭液(PBST+5%脱脂奶粉)中，室温摇动封闭1小时以上(可以在4°C封闭过夜)。
9) 用1-2 ml封闭液以合适比例稀释一抗(一般1:1000-1:5000)。
10) 采用半干结合方法，室温结合1小时。
11) 在水平摇床上，用20 ml PBST摇动洗涤膜。室温洗涤5分钟×6次。
12) 用20 ml封闭液以1：20000稀释二抗。
13) 在水平摇床上，室温摇动结合1小时。
14) 在水平摇床上，用20 ml PBST摇动洗涤膜。室温洗涤5分钟×6次。
15) 在水平摇床上，用20 ml PBS摇动洗涤膜。室温洗涤5分钟×2次。
16) 将荧光底物（SuperSigna West Femto Maximum Sensitivity Substrate，Pierce）从4°C取出。
17) 将检测试剂的溶液A与溶液B以1：1的比例混合，检测试剂的用量为20μl/cm2。
18) 膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面。
19) 室温避光放置5分钟。
20) 用镊子夹起膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂。
21) 膜用保鲜膜封起，暗室压片10秒-10分钟。
22) 显影和定影。
实验心得：暂无
已发表论文：
J Biol Chem. 2010, 285 (21): 15786-93.
The fission yeast inhibitor of growth (ING) protein Png1p functions in response to DNA damage.
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
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