参赛网友：xlj59

实验室名称（选填）：中科院营养所谢东组

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：Millipore PVDF膜（IPVH00010）　　

PVDF膜孔径：0.45 uM

使用抗体（必填）：
anti-EphA2(05-480, Millipore)
anti-a-tubulin（sc-32293, Santa Cruz）

其他实验试剂：见以下protocol

实验步骤（样品及检测底物必填）：
1)  将细胞用裂解液裂解后进行蛋白定量
2)  细胞裂解液用10%或者8%的SDS-PAGE分离蛋白
3)  裁剪PVDF膜和滤纸，与胶的大小相当但略大。将切好的膜置于甲醇中放置15s，最后将处理好的PVDF膜放入转膜缓冲液中平衡15min
4)  打开转膜用的夹子，使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫上浸泡好的6层滤纸，随后放入凝胶—PVDF膜—6层滤纸—海绵垫，每一层都不能有气泡，合上盖子，装入转膜槽中。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
5)  将转移槽放在冰上进行电泳。转膜时间要根据蛋白分子量的大小来确定，蛋白越小，时间越短，蛋白越大，时间越长，一般转膜需要0.5~2小时。对于小分子量的蛋白，最好选用0.22um的PVDF膜。
6)  转印完成后，小心将膜取下，标记一角（用于鉴定蛋白在哪个面上）。将膜用PBST漂洗3次，每次5min。漂洗后将膜放入5%脱脂奶粉进行封闭，室温下封闭2h，或者4℃冰箱过夜。
7)  将封闭后的PVDF膜用PBST漂洗3次，每次5min。洗完后将PBST尽可能沥干(但膜一定要保持湿润)，加入稀释好的一抗，摇床上室温孵育约2h。
8)  将PVDF膜用PBST漂洗3次，每次5min，加入稀释好的二抗，室温孵育1h。后将膜用PBST洗3次，每次5min。
9)  将PVDF膜转入暗室(注意保持膜湿润)，在滤纸上将膜沥干。
10)  将A和B两种试剂按照1：1的比例混合，加到膜上，大约1min后，去尽残液，保鲜膜包好，放入X-光片夹中。
11)  剪相同大小的X-Ray感光胶片，置膜上，关上暗盒。开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。
12)  曝光完成后，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，结束后把X-光片浸入超纯水中洗涤1min，再放入定影液中，以胶片透明为止，在超纯水中洗涤1min，取出室温下晾干。

实验心得（选填，有助于获得选票）：
已发表文献
Oncogene 28, 1759-1768 (16 April 2009) | doi:10.1038/onc.2009.15

EphrinA5 acts as a tumor suppressor in glioma by negative regulation of epidermal growth factor receptorEphrinA5 suppresses tumorigenesis in glioma

http://www.nature.com/onc/journal/v28/n15/full/onc200915a.html

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）