waterfairy1
来源:未知作者:admin时间:2010-11-03 11:12点击:
参赛网友：waterfairy1
实验室名称（选填）：暂无
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：采用Millipore PVDF膜（IPVH00010）
PVDF膜孔径：0.45 uM
使用抗体（必填）：
一抗：anti-E2F-1 (Cat.# 05-379SP, Lot# DAM1482857 Millipore)
anti-beta-Actin（ab6276,Abcam）
二抗：HRP标记羊抗鼠
样品：小鼠肝组织 检测底物：cdk1-cdc2
实验步骤（样品及检测底物必填）：
1) 蛋白质抽提 ：
a)贴壁型细胞: 1.培养陪吸弃培养液，PBS洗一次，弃PBS。2.加入蛋白裂解液，移液枪吹打数次，冰浴中静置。3.冷冻高速离心，去沉淀，转移清液。
b) 组织：1.加入蛋白裂解液。2.冰浴匀浆研磨至组织充分溶解。3.冷冻高速离心，去沉淀，转移清液。
2） 蛋白质定量：
BCA蛋白定量：绘制标准曲线定量样品蛋白质浓度 仪器：酶标仪（Thermo）
3) SDS-PAGE电泳：
a) 胶准备：制备10%的分离胶和4%的积层胶
b）样品准备：样品加入染液并沸水煮变形
c）电泳：加入电泳缓冲液，定量加入准备样品，BioRAD装置恒压电泳
4）蛋白质转移：
加入转膜缓冲液，在BioRAD 装置下，恒流转膜
5）封闭和孵育：
在5%的BSA中孵育2h，加入稀释一定比列的一抗，摇床温和孵育2h，TBST洗涤3次，每次5分钟，加入稀释一定比列的二抗，摇床温和孵育2h。
6）结果检测
加入反应荧光剂A和B，发生化学反应1分钟后，取出去暗室。把膜在感光盒中，后加入X-Ray感光胶片，大约30s后，取出X-ray放入显影液中显影，后放入定影液中，直至胶片清晰，可开红灯观察。根据第一次尝试曝光的时间，调整曝光时间，以达到最佳的效果。清水洗涤晾干。
7）可视化胶片与数字化灰度转变
拍摄X胶片，获取电脑可用数据，通过软件读取个样品之间亮度（灰度）的，包括内参，通过内参标准化样品之间的数据，比较差异。
8）得出实验结论
参赛图片
图中的1-9代表的是9个相同处理不同时间段样品，顺序是打乱的。（且2副图中的样品是一致相同的。）
注：图中的条带对应的KD真实有效，并非PS，只是图中去除了杂带，保留了目的条带。
谢谢大家支持！
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- 关于默克密理博
20世纪80年代，默克密理博公司进入中国市场。先后在香港、北京、上海、广州、成都及深圳设立了办事机构，并于2000年4月在上海浦东外高桥保税区建立了默克密理博（上海）贸易有限公司。 目前，默克密理博在中国拥有近150名员工，从事应用销售、市场推广、维修服务和技术支持等工作。
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