1986hstar

来源:未知作者:admin时间:2010-11-03 17:41点击:

参赛网友:1986hstar

是否采用密理博Immobilon转印膜:已采用

PVDF膜孔径:0.45um

使用抗体:一抗为密理博MILLIPORE MAB1077小鼠单抗,二抗为百汇中源BLS A101X山羊抗小鼠HRP标记。

其他实验试剂:显影液为低敏感度显影液为Thermo Prod#34080;高敏感度显影液为Thermo Prod#34095,显影条件为低敏:高敏为5:1

实验步骤:
样品为体外发育成熟的小鼠卵子,培养时间分别为0,2,4,8,9.5及12小时,对应的卵子发育时期分别为生发泡期,生发泡破裂期,第一次减数分裂前中期,第一次减数分裂中期,第一次减数分裂后末期及第二次减数分裂中期,每孔上样量为250个卵子。检测底物为HRP。
一抗稀释浓度为1:250,4℃孵育过夜(12-14小时);二抗稀释浓度为1:2000,37℃孵育1小时。

实验心得:
1、  孵育一抗前的封闭操作中,晃动的条件应柔和些,有利于提高蛋白封闭的效果。
2、  一抗浓度需要摸索,如采用杂交袋来孵育抗体则应注意不能存有气泡,否则会干扰实验结果。
3、  洗膜时在皿中放置的膜数量别太多,否则容易搭在一起,影响洗脱的效果,导致染色后背景偏高。
4、  在不确定所要条带的显色强弱的时候,应先使用低敏感度的显影液,如果显示不出,再在其中由低到高地按比例添加高敏感度的显影液进行显影。例如一开始可低敏:高敏为10:1,显示不出可调整为5:1。切忌将条带显影过重,导致条带间区分度降低。
5、上样时尽量使上样体积一致,以免相邻孔道间由于电压差异,导致条带宽度不均。
6、细节决定成败。比如需注意一抗的种属,二抗抗一抗的问题,此类问题看着简单,但是在实际操作中很容易犯。

参赛图片

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