是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　

 

PVDF膜孔径：0.22 uM 

 

使用抗体（选填）：anti-GAPDH antibogy(MAB374) 

 

其他实验试剂：常规试剂

 

实验步骤（样品及检测底物必填）：

1：提蛋白，上样，跑胶，转膜

2：丽春红染色（注：PVDF处理后也可以进行丽春红染色），剪条带，TBST洗10分钟

3：7.5%牛奶封闭60分钟

4：一抗用TBST稀释（也可用5%的BSA稀释），4度孵育过夜，一抗可回收使用（加叠氮钠，可重复用至少6-7次，很节省抗体，但要注意安全）

5：用TBST洗四遍（tween20为0.12%-0.15%)，每次15分钟

6：二抗用TBST将其1：2500稀释，30度孵育2小时

7：用TBST洗四遍，每次15分钟

8：millipore的发光液，用水将其1：7~10稀释，在暗室中进行显影。

 

实验心得（选填，有助于获得选票）：

1.蛋白是关键，只要蛋白好、量大、浓度达到，就有可能做出来；

2.抗体是第二个关键，蛋白好，抗体好，没有理由做不出来；

3.条件要有稳定性、延续性控制，这点很重要，便于重复实验，确定结果，减少时间，提高效率，并且有利于分析实验中出现的问题。因此，尽可能标准化实验中的所有步骤，比如我们的二抗规定都在30度孵育，一抗均为4度过夜，这样有利于摸抗体滴度；

4.条带好看才能正确反应结果，如果做下来条带歪七斜八，也只能勉勉强强的反应结果，因此要保证用于你结果分析的条带都是清晰地，美观的，确定的（比如条带的位置是否因为磷酸化而偏移、杂带是否为剪切体或另一个亚基等等）；

5.要把你做的蛋白研究透（包括构象、亚基、磷酸化、膜蛋白还是核蛋白还是浆蛋白等等）、把买的抗体研究透（种属、特异性、针对靶点等等），事先做预实验摸条件，同时要查与你做同样蛋白、用同样抗体的参考文献，一切弄透之后，就得心应手、尽在掌握；

6.曝光可以把胶片2-4张叠起来曝，压时间长一点，这样从下到上，由浓到淡，选择一张，杂带最少，背景最少而条带又不浅的就可以了；

7.把western的每个步骤的原理研究透，电泳的原理（思考制胶的浓度，是否要制非变性胶等等）、转膜的原理（湿转或半干转、转膜时间长短等等）、显色的原理（多种显色方法：ECL、DAB、荧光二抗也可以）、试剂中每一个试剂的作用（例如SDS、甲醇、tween20等的多重作用），这样做每一步实验的时候就心中有数，还可以自己修改、优化条件；

8.最后一个就是多做，量变到质变，积累经验，解决过各种问题之后，就能有一个宏观的把握；

9.补充一点，western很重要，可以和很多实验相连，包括免疫共沉淀、生物素转化实验等等

 

 

我摸的是一个western的准确度的实验，上的是神经元的胞浆蛋白，做的是内参GAPDH，上不同的量，最后出来的条带进行统计，比较与上样量之间的平行度（比例都是与上5ul的样品进行标准化的），发现只要western只要做得好，基本上还是能够反映样品中蛋白量的差异的（但是不是绝对反映，比实际差异要小一点，作为半定量是完全可以的），这增强了我对western的信心，也增强了对实验的信心。