实验室名称（选填）：_浙江大学邵逸夫医院生物治疗中心____

是否采用默克密理博Immobilon转印膜（必填）：__是_　　

PVDF膜孔径： 0.45 uM （任选）

使用抗体（选填）：_07-024 Anti-gp91-phox（upstate，millipore） ___
07-500 Anti-p47-phox（millipore）

实验步骤（样品及检测底物必填）：

1、制备电泳凝胶，1M Tris-Hcl(ph 6.8); 1.5M Tris-Hcl(ph 8.8)自己配的，40％双丙烯酰胺); 10% SDS; 10% AP(过硫酸胺，最好现配)；TEMED。上样量一般20-30ul 1.5mm玻板 10孔梳（条带分得比较开比较好看），10％的分离胶
2、洗干净、干燥玻板；按需要配好足量分离胶（2块板 10～15ml），胶要混匀；快速加好分离胶，用蒸馏水封液面（加水不宜过快，左右轻摇使液面水平，保证分离胶不含气泡）； 待折光线明显时（20min左右，现在冬天凝得慢有时候直接拿到37度培养箱去凝），倒掉蒸馏水，加上预先配制好的浓缩胶，插入梳子（注意不要有气泡）
3、电泳，选择恒压（浓缩胶/分离胶：80V/100～120V），电泳一般在90min左右，电泳线进入分离胶后可适当增加电压，但注意电泳线不要跑出分离胶之外。（注意在电泳时-80°冻存冰盒，以便在转膜时使用）
4、转膜 电泳结束后将胶条割至合适大小，预先裁好与胶条同样大小的滤纸和millipore PVDF膜 转膜槽整个包埋于大碎冰泡沫盒中。接通电源,恒流250mA-300mA，转移1.5～2hr
5。封闭 5％脱脂牛奶，保证膜浸入液体中（正面右上方剪角标记），平稳摇动，室温1小时
1×TBST(1000mlTBS+1ml Tween)；1×TBST洗膜10min×3次 一抗过夜，1×TBST洗膜10min×3次，加入HRP(辣根过氧化物酶)偶联的二抗 RT 1h

实验心得：

1、western blot有很多小细节需要注意，我已标在步骤中的括号内
2.转膜缓冲液可以反复使用2-3次
3.要有信心，多做几次就可以掌握该技术。

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）