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【公告】默克密理博2010年快乐“膜”术师评选活动!大奖iPod等你拿！（支持你喜欢的作品，给他投上一票！投票也有机会拿奖品！）

fangweibin119
fangweibin119
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2010-10-12 15:26 消息 引用 收藏 分享 只看楼主
这个帖子发布于2年零152天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
默克密理博2010年快乐“膜”术师评选活动

——只要提交一个漂亮的蛋白印迹图(WBlack Eye，即有机会赢取iPOD大奖!
　　　
活动期间，跟帖发表最新westernblot蛋白印迹图即可参赛，赢得实物奖品，
如果投票结果进入六甲，就有机会拿到超炫的 iPod shuffle MP3，快快行动吧！
参加投票者都有机会赢得高灵敏度WB显色液和精美小礼品一份！

（大奖以实物为准）


默克密理博2010年快乐“膜”术师评选活动自2010.10.12启动以来，从“作品提交”、“网络海选”到“最终投票”，历时2个月时间，得到了广大专业人士的鼎力支持和热情参与！不少参赛选手不仅介绍了自己的实验情况和实验结果，还详细分享了自己的实验心得，给更多实验同仁以帮助。根据活动规则，组委会票数前6名将获得iPod大奖，现公布名单如下：

获奖公布区
******************************************************************************

（详细投票情况请查看默克密理博2010年快乐“膜”术师评选活动专题页面）

6名快乐“膜”术师大奖获得者


3位最讲评论奖获得者：mumucao、fenxiangzhe、sjs0538

100名参与奖获得者：

另外，前100名投票并评论者的奖品将由默克密理博于近期统一寄出，部分会员因为没有填写详细地址无法投送，请尽快和组委会联系，
最终截止时间2011.1.30（详细名单请点击下载，联系地址：biomart@dxyer.com）

最后，感谢各位对于默克密理博2010年快乐“膜”术师评选活动的支持！
祝愿各位选手和网友实验顺利！
并祝 新年快乐！

******************************************************************************

活动详情如下：

一、活动时间

1、作品提交时间：2010.10.12 ~ 12.11
2、投票时间：2010.12.13 ~ 2010.12.24
3、奖项颁布：2011.1.1~1.10

二、参赛说明

1、参赛群体提供的参赛内容必须既使用默克密理博PVDF膜，又使用默克密理博信号转导及表观遗传学抗体，只使用其一，没有参赛权
2、参赛者以个人为代表，提供单次实验结果；
3、参赛者对所发表图片、实验流程的真实性和版权负责；

三、具体参赛方法

参赛者在规定提交作品的时间内在跟帖发表参赛帖（格式见下），并将图片以附件形式上传。

实验室名称（选填）：_______________________

是否采用默克密理博Immobilon转印膜（必填）：_______　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）

使用抗体（选填）：____________

其他实验试剂：________________

实验步骤（样品及检测底物必填）：____________

实验心得（选填，有助于获得选票）：

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）


＝＝＝＝＝＝＝＝提交截止期之后，作品将统一审核并加入至投票页面＝＝＝＝＝＝＝
　　（投票页面将在2010年12月正式启动，近期发布的作品会陆续放置在上面，供大家评论）

四、奖项说明

1、“膜“术师：6名，依次由票数前6名的参赛者获得，票数相同者并列为两名。
奖品为：默克密理博提供的“膜”术师证书+ iPod shuffle

2、最佳评论奖：3名，参与投票并发表优质评论者，由丁香园蛋白质版版主共同评定。
奖品：丁香园DIY记事本

3、参与奖：前100名投票并评论者，由默克密理博公司赠出。

奖品为精美小礼品（魔力吸水杯垫）+ 默克密理博Luminata高灵敏度WB显色试剂（20ml）

4、奖品发放：由丁香园和默克密理博公司在奖项公布后两周内联系获奖者兑奖

活动申明：所有的参赛作品，版权归参赛者和丁香园所有，丁香园有权将其作品进行再编辑和整理。该活动由默克密理博公司和丁香园共同负责解释。

本次活动独家支持：默克密理博（上海）贸易有限公司

系列活动回顾：

丹丹博士与您一起优化Western Blotting方案（视频课堂）

2010年默克密理博亚洲生物高峰论坛暨“干细胞研究与表观遗传学的科学前沿”
版主admin留言:
不方便留实验室名称的，请站内短信息通知我
没有使用密理博的抗体及膜的战友帖子会被删除，请谅解
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admin edited on 2011-01-12 10:20 举报
fangweibin119
fangweibin119
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2010-10-12 15:30 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：北京华肽先锋生物科技有限公司

是否采用默克密理博Immobilon转印膜（必填）：已采用
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选） 0.45um

使用抗体（必填）：_AQP4（AB3068）

其他实验试剂：_Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate

实验步骤（样品及检测底物必填）：_大鼠脑组织，Luminol__

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、优良的抗体是保证
2、ECL的敏感性是关键
3、目的蛋白的提取试剂及蛋白酶抑制剂是核心
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
注：图中不同条带为不同组别大鼠脑组织样品
版主admin留言:
第1号作品

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admin edited on 2010-11-04 16:33 举报
yds2008
yds2008
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医师认证内科

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2010-10-12 22:36 消息 引用 收藏 分享
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：milipore
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选） 0.45um

使用抗体（必填）：ERK1/2（CST，4695）

其他实验试剂：山羊抗兔二抗（碧云天）+ECL发光液(milipore)
实验步骤（样品及检测底物必填）：大鼠脑组织，ERK1/2
实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、一抗是做出好条带的关键，CST还是不错的，尤其是做信号转导。
2、选择合理的曝光时间很重要。
参赛图片
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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:26 举报
12223youming
12223youming
入门站友

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2010-10-13 08:54 消息 引用 收藏 分享
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）0.45 uM

使用抗体（必填）：smad4

其他实验试剂：ECL发光液（millipore）
实验步骤（样品及检测底物必填）：系膜细胞 HRP标记羊抗鼠

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1.实验中的细心很重要；
2.发光液很重要，用过好几种，最后发现还是millipore的好用
3.相关基础知识的掌握也很重要
版主fangweibin119留言:
请给出抗体公司及货号

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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:31 举报
liuhongfu
liuhongfu
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医师认证普外科

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2010-10-13 10:07 消息 引用 收藏 分享
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）0.45 uM

使用抗体（必填）：beta-actin
其他实验试剂：DAB
实验步骤（样品及检测底物必填）：人肝癌细胞 HRP标记羊抗兔

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1.一抗要选好；
2.关键步骤不能大意；3.摸索适合本实验室的条件要成熟。
版主fangweibin119留言:
请标出抗体公司及货号

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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:30 举报
sunnyxia
sunnyxia
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2010-10-13 10:07 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：xxxxx

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM

使用抗体（必填）：mCherry mAb (clontech 632543)

其他实验试剂：Goat Anti-MoustIgG (H+L)(Millipore:12-349) ；Blue Marker；color Marker；Streptatin-HRP；Chemiluminescent detection kit;Kodak XAR-2 Film

实验步骤（样品及检测底物必填）：Hek293 mCherry cell lysate

实验心得（选填，有助于获得选票）：

1.试剂的配制要准确，SDS－PAGE电泳结果要好。这是很容易忽视的问题。
2.查资料说选膜也很关键，但是一直使用Millipore的膜，没有比较过。
3.抗体的选择和稀释倍数可以，减少非特异性带的出现保证出现比较好看的结果。
4.最好使用预染marker，很容易就知道是否转膜成功
版主fangweibin119留言:
请给出抗体公司及货号

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sunnyxia edited on 2010-11-01 21:52 举报
superr9
superr9
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医师认证生殖中心(医学生)

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2010-10-13 11:02 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：南京医科大学生殖实验室

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：已采用
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选） 0.45um

使用抗体（必填）：CLDN8（AV33621）

其他实验试剂：_Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate

实验步骤（样品及检测底物必填）：人胎盘组织，HRP标记羊抗兔__

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、好的抗体是实验成功的保证
2、目的蛋白的提取和保存对实验结果也很重要
3、选择合理的曝光条件。
4、细心、耐心和恒心，你会成功
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
注：图中不同条带为不同组别人胎盘组织样品
版主fangweibin119留言:
请给出抗体公司名称及货号

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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:33 举报
superr9
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医师认证生殖中心(医学生)

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2010-10-13 11:28 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：南京医科大学生殖实验室

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：已采用
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选） 0.45um

使用抗体（必填）：CLDN4（32-9400(lot：686955A)）

其他实验试剂：_Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate

实验步骤（样品及检测底物必填）：BeWo细胞，HRP标记羊抗小鼠__

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、严格掌握实验原理，灵活调节实验步骤；
2、遇到问题善于分析、讨论，用于探索尝试；
3、永不言弃
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
注：图中不同条带为不同组别BeWo细胞样品
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funking
funking
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2010-10-13 12:15 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：武汉大学人民医院

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：已采用（Millpore IFPL 00010,低荧光背景膜）
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径： 0.45um

使用抗体（必填）：P-ERK1/2(Millipore,05-481;Anti-phospho-ERK1/2,Clone 12D4)
其他实验试剂：磷酸酶抑制剂；荧光标记二抗（IRD 800CW,Donkey anti Rabbit）

实验步骤（样品及检测底物必填）：KO/TG小鼠心脏，荧光标记二抗

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、蛋白的提取及蛋白酶抑制剂的使用非常关键；
2、抗体的效价也非常重要；
3、使用低荧光背景的膜，有利于降低背景
参赛图片
注：图中不同条带为不同组别小鼠心脏组织样品
版主fangweibin119留言:
请给出抗体公司名称及货号


p+-ERK1&2.jpg(494.13k) 在线查看
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funking edited on 2010-11-09 21:39 举报
moccay
moccay
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2010-10-13 13:40 消息 引用 收藏 分享
大家多交流，已经开始投票，请帖来更好的片子！
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xlj59
xlj59
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2010-10-13 14:36 消息 引用 收藏 分享
版主，我是新手，如何评判膜图的质量？
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xlj59 edited on 2010-10-13 15:53 举报
1986hstar
1986hstar
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2010-10-13 16:24 消息 引用 收藏 分享
实验室名称：中科院动物所生殖室
是否采用密理博Immobilon转印膜：已采用

PVDF膜孔径：0.45um

使用抗体：一抗为密理博MILLIPORE MAB1077小鼠单抗DYNLT3，二抗为百汇中源BLS A101X山羊抗小鼠HRP标记。

其他实验试剂：显影液为低敏感度显影液为Thermo Prod#34080；高敏感度显影液为Thermo Prod#34095，显影条件为低敏：高敏为5:1。

实验步骤：
样品为体外发育成熟的小鼠卵子，培养时间分别为0,4,8及9.5小时，对应的卵子发育时期分别为生发泡期，第一次减数分裂前中期，第一次减数分裂中期及第一次减数分裂后末期，每孔上样量为280个卵子。检测底物为HRP。
一抗稀释浓度为1:250,4℃孵育过夜（12-14小时）；二抗稀释浓度为1:2000,37℃孵育1小时。

实验心得：
1、  孵育一抗前的封闭操作中，晃动的条件应柔和些，有利于提高蛋白封闭的效果。
2、  一抗浓度需要摸索，如采用杂交袋来孵育抗体则应注意不能存有气泡，否则会干扰实验结果。
3、  洗膜时在皿中放置的膜数量别太多，否则容易搭在一起，影响洗脱的效果，导致染色后背景偏高。
4、  在不确定所要条带的显色强弱的时候，应先使用低敏感度的显影液，如果显示不出，再在其中由低到高地按比例添加高敏感度的显影液进行显影。例如一开始可低敏：高敏为10:1，显示不出可调整为5:1。切忌将条带显影过重，导致条带间区分度降低。
5、上样时尽量使上样体积一致，以免相邻孔道间由于电压差异，导致条带宽度不均。
6、细节决定成败。比如需注意一抗的种属，二抗抗一抗的问题，此类问题看着简单，但是在实际操作中很容易犯。
参赛图片
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1986hstar edited on 2010-11-04 08:39 举报
woshiwo61
woshiwo61
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2010-10-13 17:02 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：___北京大学医学部____________________

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：__是_____　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）0.45

使用抗体（必填）：_Flotillin_（BD Biosciences, 货号610821）_

其他实验试剂：___增强型ECL发光液（Pierce）___

实验步骤（样品及检测底物必填）：__ ____
样品：小鼠脑组织；梯度蔗糖分离体系分离脂筏，从1到10组分，样品蔗糖含量逐渐增高。
底物：HRP标记山羊抗小鼠。

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1，  蛋白电泳顺序，在积层胶低电压（60V）；分离胶用高电压（120V）；蛋白分开到理想状态前或后低电压（60V）再跑一段时间，使条带更实、齐。
2，  抗体封闭液，一般使用5%脱脂奶粉；然而有些抗体需要使用BSA作为封闭剂，需要仔细看说明书，再进行选择。
3，  抗体孵育，一抗四度过夜；二抗四度4-6小时，结果更加稳定；视不同抗体和具体情况，室温孵育需要摸条件。
4，  ECL孵育PVDF膜的同时，可以在暗室观察膜上是否有条带，防止信号过量，发光的时候由于荧光淬灭条带不完整；同时可以判断最好信号的孵育时间。
5，  抗体的特异性非常重要，推荐根据阅读的可靠文献选择抗体，一旦出现问题可以与公司技术支持交流找到解决问题方案。

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
脂筏组分分离：
对照：1-3组分
脂筏：4-5组分
过度：6-8组分
非脂筏：9-10组分
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woshiwo61 edited on 2010-11-02 19:08 举报
henkally
henkally
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2010-10-13 19:26 消息 引用 收藏 分享
我也来一个：
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）：0.45 uM

使用抗体（必填）：anti-D1
其他实验试剂：ECL发光液（pierce)

实验步骤（样品及检测底物必填）：植物叶绿体核心蛋白D1
实验心得（选填，有助于获得选票）：
1.一抗选择很重要，抗体好了很容易做出来.

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
注：图中不同条带为不同处理条件下D1的讲解情况（总共6个泳道，第2，3，5，6降解严重）。
版主fangweibin119留言:
请标出抗体公司名称及货号

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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:38 举报
gyy0811
gyy0811
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2010-10-13 22:42 消息 引用 收藏 分享
版主，为什么看图片还要叮当啊？
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xiaodu2891
xiaodu2891
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2010-10-13 23:37 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：广州市神经科学研究所
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：已采用
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选） 0.22um

使用抗体（必填）：一抗为LIMK1（sigma公司）货号L2290
其他实验试剂：ECL发光液（碧云天)

实验步骤（样品及检测底物必填）：小鼠脑组织，HRP标记羊抗兔__
1、蛋白质量是成功的第一步
2、电泳条件120V（恒压）20min，100v分离胶 50min
3、转膜条件：湿转2h，100v（恒压）
4、封闭：5%脱脂奶粉，RT,1h
5、一抗孵育：4度，过夜（一抗最关键，质量好的抗体+合适的稀释度+反应条件）
6、二抗孵育：RT,1h，避光
以上是做WB的基本条件和步骤，然后根据不同的蛋白再适当调整。

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、抗体是最重要的（选了好几个公司的抗体，最后买了sigma的才做出来）
2、ECL发光需选择不同时间点
3、目的蛋白的提取是核心
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
注：图中不同条带为不同年龄小鼠脑组织样品
上面8条带为LIMK1条带
下面8条带为actin内参条带
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xiaodu2891 edited on 2010-10-13 23:42 举报
盗盗
盗盗
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2010-10-14 09:42 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：南京医科大学生殖医学实验室

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：已采用
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选） 0.45um

使用抗体（必填）：ZO-1 61-7300(690090A)
其他实验试剂：_Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate

实验步骤（样品及检测底物必填）：Bewo cell，HRP标记驴抗兔__

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、选择合适的蛋白提取液。
2、蛋白分子量大小不同选择合适的配胶浓度。
3、摸索出适合本实验室的电泳和转膜条件。
4、合适的曝光时间和曝光模式很重要
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
注：图中不同条带为不同组别Bewo cell样品
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请标出抗体公司名称及货号

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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:39 举报
克林斯曼
克林斯曼

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2010-10-14 10:05 消息 引用 收藏 分享
gyy0811 wrote:
版主，为什么看图片还要叮当啊？


因为一些tif格式的图片不能直接显示，
有些网友在上传时选择了“需要消费丁当才能下载”，去掉“勾选”即可
　　
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superwen
superwen
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2010-10-14 10:13 消息 引用 收藏 分享
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：_已采用　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）： 0.22 uM

使用抗体（必填）：一抗：anti-phospho-Histone H3 (ser10)，Millipore, Cat.# 06-570,
二抗：IRDye 800CW anti-Rabbit Ig(H+L) antibody: LI-COR Biosciences, Cat: 926-32211

实验步骤（样品及检测底物必填）：
样品：肿瘤组织匀浆液，检测采用 Odyssey system (LI-COR Biosciences) 荧光成像

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1，实验条件：对于17KD小分子蛋白，本实验电泳采用自制的15% SDS-Page gel，转膜采用Millipore的PVDF膜，0.22 uM， 200mA，30min，。
2，电泳上样量跟细胞中目的蛋白表达量以及抗体的敏感度都有关系，本实验上样10ug（总蛋白定量），一抗稀释比例在1：1000-1：5000均可，室温 2h，二抗 1：5000，室温1h。膜上是否有杂带跟一抗特异性有最直接的关系，从结果来看，一抗anti-phospho-Histone H3 (ser10)敏感度高，特异性好。
3，二抗标记近红外荧光报告基团IRDye 800CW，使用Odyssey system荧光成像，比普通化学发光方法更便捷。

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照）
版主fangweibin119留言:
请重新上传图片

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superwen edited on 2010-11-03 22:04 举报
licun20036063
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2010-10-14 13:59 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：_______________________

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.45 uM

使用抗体（必填）：一抗：abcam mouse anti-human secretory component
二抗：中山金桥 HRP-山羊抗小鼠IgG

其他实验试剂：millipore ECL发光液

实验步骤（样品及检测底物必填）：细胞培养上清SIgA
实验心得（选填，有助于获得选票）：
1、非还原电泳最重要的是对于样品的处理，水浴的时间的把握；
2、对于（SIgA 400KD）大分子量蛋白选择合适浓度的蛋白胶非常重要；
3、在实验过程中摸索合适的加样量，抗体稀释倍数以及曝光时间，由于最大条带与最小条带相差甚大，故需要平衡各个实验要素。
参赛图片
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请标出抗体公司名称及货号

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fangweibin119 edited on 2010-11-01 19:42 举报
cly11157
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2010-10-14 21:56 消息 引用 收藏 分享
实验室名称：中山大学附属第一医院

是否采用密理博Immobilon转印膜：是　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM 0.22 uM

使用抗体：R＆D的一抗及二抗

其他实验试剂：Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate

实验步骤（样品及检测底物必填）：  PC12细胞，检测MnSOD

实验心得（选填，有助于获得选票）：
1. 一抗是做出好条带的关键，首推CST、R＆D、Abcam。
2. 二抗也同样非常重要，在你增加一抗浓度及蛋白上样量后仍做不出来，要考虑是否你的二抗出现了问题，推荐CST、R＆D。
3. 合理选择胶的浓度，小分子量蛋白低电压跑。
4. 合理调整蛋白的上样量，不同的蛋白需要不同的上样量。
5. 发光液很重要，同学用过都说millipore的好。
6. 选择合理的曝光时间及显、定影时间将使你的图片更漂亮
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cly11157 edited on 2010-10-14 22:28 举报
xlj59
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2010-10-15 11:14 消息 引用 收藏 分享
代发
实验室名称（选填）：中科院营养所谢东组

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：Millipore PVDF膜（IPVH00010）　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.45 uM

使用抗体（必填）：
anti-EphA2(05-480, Millipore)
anti-a-tubulin（sc-32293, Santa Cruz）

其他实验试剂：见以下protocol

实验步骤（样品及检测底物必填）：
1)  将细胞用裂解液裂解后进行蛋白定量
2)  细胞裂解液用10%或者8%的SDS-PAGE分离蛋白
3)  裁剪PVDF膜和滤纸，与胶的大小相当但略大。将切好的膜置于甲醇中放置15s，最后将处理好的PVDF膜放入转膜缓冲液中平衡15min
4)  打开转膜用的夹子，使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫上浸泡好的6层滤纸，随后放入凝胶—PVDF膜—6层滤纸—海绵垫，每一层都不能有气泡，合上盖子，装入转膜槽中。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
5)  将转移槽放在冰上进行电泳。转膜时间要根据蛋白分子量的大小来确定，蛋白越小，时间越短，蛋白越大，时间越长，一般转膜需要0.5~2小时。对于小分子量的蛋白，最好选用0.22um的PVDF膜。
6)  转印完成后，小心将膜取下，标记一角（用于鉴定蛋白在哪个面上）。将膜用PBST漂洗3次，每次5min。漂洗后将膜放入5%脱脂奶粉进行封闭，室温下封闭2h，或者4℃冰箱过夜。
7)  将封闭后的PVDF膜用PBST漂洗3次，每次5min。洗完后将PBST尽可能沥干(但膜一定要保持湿润)，加入稀释好的一抗，摇床上室温孵育约2h。
8)  将PVDF膜用PBST漂洗3次，每次5min，加入稀释好的二抗，室温孵育1h。后将膜用PBST洗3次，每次5min。
9)  将PVDF膜转入暗室(注意保持膜湿润)，在滤纸上将膜沥干。
10)  将A和B两种试剂按照1：1的比例混合，加到膜上，大约1min后，去尽残液，保鲜膜包好，放入X-光片夹中。
11)  剪相同大小的X-Ray感光胶片，置膜上，关上暗盒。开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。
12)  曝光完成后，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，结束后把X-光片浸入超纯水中洗涤1min，再放入定影液中，以胶片透明为止，在超纯水中洗涤1min，取出室温下晾干。

实验心得（选填，有助于获得选票）：
已发表文献
Oncogene 28, 1759-1768 (16 April 2009) | doi:10.1038/onc.2009.15

EphrinA5 acts as a tumor suppressor in glioma by negative regulation of epidermal growth factor receptorEphrinA5 suppresses tumorigenesis in glioma

http://www.nature.com/onc/journal/v28/n15/full/onc200915a.html

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
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xlj59 edited on 2010-10-15 11:19 举报
zoe_091008
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2010-10-15 11:48 消息 引用 收藏 分享
那怎么联系本人呢？
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xuwen7761
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2010-10-15 23:59 消息 引用 收藏 分享
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xuwen7761 edited on 2010-10-16 00:04 举报
xuwen7761
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2010-10-16 00:03 消息 引用 收藏 分享
我也要参与
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shallby1
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2010-10-16 09:49 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：协和医科院基础所
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）0.45um

使用抗体（必填）：07-030 H3K4Me2


其他实验试剂：Millipore HRP发光底物 WBKLS0100
实验步骤（样品及检测底物必填）：
1：跑胶，转膜
2：用TBST洗两遍，每次10分钟
3：5%牛奶封闭30分钟
4：TBST洗5分钟
5：一抗用TBST稀释，4度孵育2小时
6：用TBST洗三遍，每次10分钟
7：二抗（中衫金桥）用TBST将其1：7500稀释，室温孵育40分钟
8：用TBST洗三遍，每次10分钟
9：millipore的发光液，用水将其1：7~10稀释，在暗室中进行显影。

07-030 H3K4Me2 （1：20000）曝光时间：5秒 600ng core histone（from Hela）空白或弱的泳道为加酶的阳性对照

实验心得（选填，有助于获得选票）：
无他，唯手熟尔

参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
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shallby1 edited on 2010-10-16 09:52 举报
panxian0527
panxian0527
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2010-10-17 22:32 消息 引用 收藏 分享
实验室名称：复旦大学生科院遗传所吕红组
是否采用密理博Immobilon转印膜：millipore PVDF膜
PVDF膜孔径：0.45 uM
使用抗体：抗体：
anti-histone H4 (07-108; Millipore)；
anti-acetyl histone H4 (Lys5) (07-327; Millipore)；
anti-acetyl histone H4 (Lys8) (07-328; Millipore )；
anti-acetyl histone H4 (Lys12) (07-323; Millipore )。
其他实验试剂：显色液
实验步骤（样品及检测底物必填）：
Western blot步骤
1) SDS-PAGE分离蛋白。
2) 如果采用PVDF膜转移，先用甲醇浸湿PVDF膜，再转移到电转移液中平衡15分钟。如果采用硝酸纤维素膜转移，直接将该膜转移到电转移液中平衡15分钟。
3) 将电泳胶浸泡于电转移液中平衡15分钟。
4) 裁12张与电泳胶同样大小的Whatman滤纸，置电转移液中平衡。
5) 按下列顺序安放在半干式电转移仪(Biorad)上：正极—6层滤纸—PVDF膜 或者硝酸纤维素膜—电泳胶—6层滤纸—负极。
6) 电转移：电压23V，0.4~1小时。蛋白越小，时间越短，蛋白越大，时间越长。
7) 电转移完成以后，可以对电泳胶染色。同时可将PVDF膜或者硝酸纤维素膜上含有Marker的部分剪下染色，观察电转移的效果。
8) 在水平摇床上，将膜置于20 ml封闭液(PBST+5%脱脂奶粉)中，室温摇动封闭1小时以上(可以在4°C封闭过夜)。
9) 用1-2 ml封闭液以合适比例稀释一抗(一般1:1000-1:5000)。
10) 采用半干结合方法，室温结合1小时。
11) 在水平摇床上，用20 ml PBST摇动洗涤膜。室温洗涤5分钟×6次。
12) 用20 ml封闭液以1：20000稀释二抗。
13) 在水平摇床上，室温摇动结合1小时。
14) 在水平摇床上，用20 ml PBST摇动洗涤膜。室温洗涤5分钟×6次。
15) 在水平摇床上，用20 ml PBS摇动洗涤膜。室温洗涤5分钟×2次。
16) 将荧光底物（SuperSigna West Femto Maximum Sensitivity Substrate，Pierce）从4°C取出。
17) 将检测试剂的溶液A与溶液B以1：1的比例混合，检测试剂的用量为20μl/cm2。
18) 膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面。
19) 室温避光放置5分钟。
20) 用镊子夹起膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂。
21) 膜用保鲜膜封起，暗室压片10秒-10分钟。
22) 显影和定影。
实验心得（选填，有助于获得选票）：
已发表论文：
J Biol Chem. 2010, 285 (21): 15786-93.
The fission yeast inhibitor of growth (ING) protein Png1p functions in response to DNA damage.
参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照 ）
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xlj59
xlj59
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2010-10-18 13:25 消息 引用 收藏 分享
楼上的步骤真详细，赞！
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鱼小
鱼小

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2010-10-18 21:38 消息 引用 收藏 分享
支持活动。但是有一条严重打击积极性！

1、参赛群体提供的参赛内容必须既使用密理博PVDF膜，又使用密理博信号转导及表观遗传学抗体，只使用其一，没有参赛权
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xlj59
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2010-10-19 10:08 消息 引用 收藏 分享
感谢楼上的票！
版主，最佳评论奖的奖品是什么样的？
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克林斯曼
克林斯曼

丁香园助理版主

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2010-10-19 17:35 消息 引用 收藏 分享
xlj59 wrote:
感谢楼上的票！
版主，最佳评论奖的奖品是什么样的？


点击这里，查看真相
http://www.dxyer.cn/upload/92/453/p_44227.jpg
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longhao126
longhao126
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2010-10-21 11:34 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：天津医科大学免疫实验室

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.45 uM

使用抗体（必填）：millipore anti-stat6 (clone 8c12) catalog#05-589

其他实验试剂：

实验步骤（样品及检测底物必填）：stat6。

实验心得（选填，有助于获得选票）：
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xiaozhang126
xiaozhang126
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2010-10-22 11:04 消息 引用 收藏 分享
xlj59 wrote:
代发
实验室名称（选填）：中科院营养所谢东组

是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：Millipore PVDF膜（IPVH00010）　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.45 uM

使用抗体（必填）：
anti-EphA2(05-480, Millipore)
anti-a-tubulin（sc-32293, Santa Cruz）

其他实验试剂：见以下protocol

实验步骤（样品及检测底物必填）：
1)  将细胞用裂解液裂解后进行蛋白定量
2)  细胞裂解液用10%或者8%的SDS-PAGE分离蛋白
3)  裁剪PVDF膜和滤纸，与胶的大小相当但略大。将切好的膜置于甲醇中放置15s，最后将处理好的PVDF膜放入转膜缓冲液中平衡15min
4)  打开转膜用的夹子，使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫上浸泡好的6层滤纸，随后放入凝胶—PVDF膜—6层滤纸—海绵垫，每一层都不能有气泡，合上盖子，装入转膜槽中。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
5)  将转移槽放在冰上进行电泳。转膜时间要根据蛋白分子量的大小来确定，蛋白越小，时间越短，蛋白越大，时间越长，一般转膜需要0.5~2小时。对于小分子量的蛋白，最好选用0.22um的PVDF膜。
6)  转印完成后，小心将膜取下，标记一角（用于鉴定蛋白在哪个面上）。将膜用PBST漂洗3次，每次5min。漂洗后将膜放入5%脱脂奶粉进行封闭，室温下封闭2h，或者4℃冰箱过夜。
7)  将封闭后的PVDF膜用PBST漂洗3次，每次5min。洗完后将PBST尽可能沥干(但膜一定要保持湿润)，加入稀释好的一抗，摇床上室温孵育约2h。
8)  将PVDF膜用PBST漂洗3次，每次5min，加入稀释好的二抗，室温孵育1h。后将膜用PBST洗3次，每次5min。
9)  将PVDF膜转入暗室(注意保持膜湿润)，在滤纸上将膜沥干。
10)  将A和B两种试剂按照1：1的比例混合，加到膜上，大约1min后，去尽残液，保鲜膜包好，放入X-光片夹中。
11)  剪相同大小的X-Ray感光胶片，置膜上，关上暗盒。开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。
12)  曝光完成后，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，结束后把X-光片浸入超纯水中洗涤1min，再放入定影液中，以胶片透明为止，在超纯水中洗涤1min，取出室温下晾干。

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Oncogene 28, 1759-1768 (16 April 2009) | doi:10.1038/onc.2009.15

EphrinA5 acts as a tumor suppressor in glioma by negative regulation of epidermal growth factor receptorEphrinA5 suppresses tumorigenesis in glioma

http://www.nature.com/onc/journal/v28/n15/full/onc200915a.html

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用X光片来保存结果的，不太多见好像。
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xiaozhang126
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2010-10-22 11:10 消息 引用 收藏 分享
实验室名称：清华大学医学院

是否采用密理博Immobilon转印膜：millipore PVDF膜

PVDF膜孔径：0.45 uM

使用抗体：Chemicon NMDAR1 1st antibody 1:333, 2nd antibody 1:1666：

其他实验试剂：Millipore western 加速器 SNAP i.d.

实验步骤（样品及检测底物必填）：小鼠脑组织匀浆

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warrior46
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2010-10-27 00:28 消息 引用 收藏 分享
实验室名称（选填）：协和医科院基础所
是否采用密理博Immobilon转印膜（必填）：是　　
　　　　　　　　　　　　
PVDF膜孔径：0.22 uM / 0.45 uM （任选）0.45um

使用抗体（必填）：Millipore 07-441 H3K9Me3

其他实验试剂：Millipore HRP发光底物 WBKLS0100

实验步骤（样品及检测底物必填）：
1：跑胶，转膜
2：用TBST洗两遍，每次10分钟
3：5%牛奶封闭30分钟
4：TBST洗5分钟
5：一抗用TBST稀释，4度孵育2小时
6：用TBST洗三遍，每次10分钟
7：二抗（中衫金桥）用TBST将其1：7500稀释，室温孵育40分钟
8：用TBST洗三遍，每次10分钟
9：millipore的发光液，用水将其1：7~10稀释，在暗室中进行显影。

07-441 H3K9Me3 （1：1000） 曝光时间：30秒 600ng core histone（from Hela）空白或弱的泳道为加酶的阳性对照

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参赛图片（附图，请清晰标注样品及对照）
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